Tekniken i bioteknik
På denna sida presenterar vi de biologiska molekyler som används inom bioteknik och förklarar grundprinciperna för genteknik. Därefter tar vi upp några aktuella problemställningar och hur dessa kan lösas med moderna metoder.
Biotekniken ger nya läkemedel
Du kanske har lagt märke till att de nya beta-interferonerna kallas ”rekombinanta proteiner”. De framställs med hjälp av bioteknik.
Beta-interferonerna tillhör det växande antal läkemedel som framställs på detta sätt och som nu har blivit en del av vår vardag. Vissa räddar liv medan andra förbättrar livskvaliteten för miljontals människor.
Trots det väcker dessa läkemedel ibland oro därför att framställningsmetoderna bygger på genteknik. Har du funderat över hur ”rekombinanta läkemedel” framställs?
En djupare förståelse av bioteknikens grunder och metoder kanske kan bidra till att dämpa oro och osäkerhet genom att skapa insikter om varför denna metod är så värdefull.
En definition av bioteknik
bi-o-tek-nik
Utvecklingen av tekniker som använder biologiska processer i tillverkningen av material för medicinskt och industriellt bruk. Exempelvis är framställningen av många antibiotika avhängig av olika svampars och bakteriers aktivitet. Nya gentekniska metoder har möjliggjort storskalig framställning av hormoner, vacciner, interferoner och andra användbara produkter.
Oxford Concise Medical Dictionary
Värdet av bioteknik - därför är proteiner livsnödvändiga
Många av bioteknikens produkter är ”rekombinanta proteiner”.
Proteiner är livsnödvändiga strukturella och reglerande molekyler och vissa av dem kan användas inom medicinen. Exempelvis kan man använda humanproteiner till att behandla sjukdomar som orsakas av proteinbrist.
Man har länge känt till humanproteiners värde i behandlingen av sjukdomar, men det går bara att utvinna mycket små mängder protein från människans vävnader.
Tack vare biotekniken kan man emellertid nu producera tillräckliga mängder humanproteiner av så god kvalitet att de kan användas inom medicinen.
Grundprincipen är enkel: DNA i generna kodar för en mall som kallas RNA, som i sin tur kodar för proteiner (se diagrammet). Biotekniken tillämpar denna princip i storskalig produktion av läkemedel.
De första stegen
För att förstå hur bioteknik kan användas till att framställa terapeutiska proteiner, ska vi gå tillbaka till 1944 då vetenskapsmän upptäckte att genetisk information finns lagrad i deoxribonukleinsyra (DNA) i cellkärnan, inte i proteiner som man tidigare trott.
Denna upptäckt innebar ett genombrott därför att den var det första steget mot bioteknikens allra viktigaste princip, nämligen att gener bär en kod för proteiner.
1953 visade Crick och Watson hur detta kunde fungera genom att dechiffrera själva DNA-strukturen med hjälp av experimentella data som tillhandahölls av Maurice Wilkins och Rosalind Franklin. 1962 belönades de med Nobelpriset i medicin för sitt arbete.
Crick och Watson visade att DNA består av två mycket långa kedjor av enkla, återkommande enheter, som slingrar sig om varandra i en dubbelhelix. Varje kedja har en ”ryggrad” från vilken olika ”pinnar” (baser) skjuter inåt, som i en spiraltrappa. Det finns fyra olika baser: adenin, guanin, thymin och cytosin. På grund av deras strukturella och elektriska egenskaper bildar adenin alltid par thymin och cytosin med guanin.
Kodonet knäcks
Crick och Watson insåg konsekvenserna av DNA-kedjans struktur. Om man drar isär dubbelhelixen får man två enkla kedjor. Basernas sätt att bilda par innebär att var och en av enkelkedjorna utgör en mall med hjälp av vilken en exakt kopia av modermolekylen kan framställas.
Detta är viktigt eftersom ärftlighet beror på exakt reproduktion. I bilden till höger ser du att detta är inneboende i DNAs struktur.
- Ursprunglig modermolekyl
- Första generationens dottermolekyl
- Andra generationens dottermolekyl
Crick och Watson föreslog att sekvensen av baser i DNA-molekylen på något sätt kodar för proteiner.
I början av 1960-talet knäckte forskarna slutligen den genetiska koden. De visade att enheten för genetisk information är en sekvens om tre baser, kallade en kodon. Varje kodon bestämmer en enda aminosyra.
DNA-koden för proteiner
Det finns 21 olika aminosyror och dessa är alla proteiners grundläggande byggstenar. I ett protein sammanbinds aminosyrorna ände vid ände till en lång sträng, som är vriden till en komplex tredimensionell form. En kodonsekvens i DNA som bestämmer ett proteins hela sekvens av aminosyror kallas för en gen. En typisk människocell har cirka 100 000 gener i sitt DNA.
Så här bildas ett protein
Vid bildning av ett protein skiljs de två DNA-strängarna åt utmed en gens hela längd. Därigenom blottläggs en mall på vilken en dotternukleinsyra, kallad ribonukleinsyra (eller RNA), kan bildas av enzymet RNA-polymeras.
Denna process kallas transkription därför att genetisk information transkriberas, eller ”skrivs med ett annat skriftsystem” (se bilden).
RNA
När RNA-strängen har bildats, vandrar den från kärnan till cytoplasmans stora proteinbyggande fabriker – ribosomerna – som översätter sekvensen av kodon till den specificerade strängen av aminosyror så att de bildar ett protein. Denna process kan liknas vid att översätta instruktioner från ett språk till ett annat.
Ribosomer
Från ribosomerna matas nybildade proteiner in i en förpackningsfabrik – det endoplasmatiska retiklet – där de täcks med kolhydratkedjor så att ett funktionellt proteinkomplex bildas. Denna slutliga förpackning kallas glykosylering. Den har viktiga konsekvenser för biotekniken, som vi senare kommer att se.
Bioteknikens genombrott
Alla celler använder samma maskineri till att tillverka proteiner med hjälp av DNA, t.o.m. mycket enkla celler som bakterier. Faktum är att biotekniken blev möjlig först när flera viktiga proteiner (enzymer) upptäcktes i bakterier och virus i början på 1970-talet. Till dessa hör:
- restriktionsendonukleaser (som kapar DNA på vissa ställen)
- DNA-ligaser (som limmar ihop DNA-fragment ände mot ände)
- omvänt transkriptas (som vänder transkriptionen från RNA till DNA)
Dessa enzymer är bioteknikens verktyg. De kan användas till att klyva och därefter rekombinera viktiga humana gener med bakteriers DNA.
Rekombination av humana och bakteriella gener utgör grunden för rekombinant DNA-teknik, som är bioteknikens centrala princip. Det är en värdefull teknik därför att bakterier delar sig mycket snabbt. Vid rätt förhållanden fördubblas antalet bakterier var 20:e minut. Detta innebär att de kan användas till att framställa stora mängder protein för medicinskt bruk.
Den moderna syntesen
Vid framställning av ett rekombinant protein isolerar man först humant DNA och delar upp det med hjälp av ett restriktionsendonukleas. På så sätt får man en mängd karakteristiska DNA-fragment som innehåller vissa gener.
Därefter upprepar man processen med bakteriellt DNA, varav en del finns i cirkelformade strukturer kallade plasmider. Om man använder rätt ”kniv” räcker det vanligtvis skära av slingan på endast ett ställe.
Därefter blandar man ett fragment av humant DNA, som bär den gen man behöver, med den öppnade bakteriella plasmiden.
Plasmider
Slutligen rekombinerar man de humana och bakteriella fragmenten med ett DNA-ligas för att skapa en ny plasmid som innehåller den mänskliga genen.
När en rekombinant DNA-plasmid har framställts måste den transplanteras tillbaka in i bakterierna så att den kan användas till att producera det aktuella proteinet. Denna teknik kallas transfektion. Bakterier som innehåller den mänskliga genen i sina plasmider odlas i cellkultur och börjar syntetisera det humana rekombinanta proteinet med det egna cellulära maskineriet.
Tänka stort
Att med dessa metoder framställa ett rekombinant protein för medicinskt bruk i industriell skala är tekniskt mycket krävande, med bl.a. varsam materialhantering och avancerad kvalitetskontroll.
De viktigaste produktionsstegen är:
- fermentering – bakterier odlas i en serie förslutna fat med en näringsbuljong (kultur)
- skörd – efter fermenteringen utvinner man proteinet från cellerna genom att centrifugera dem
- raffinering – det aktuella proteinet isoleras från cirka 5 000 normala bakteriella proteiner med sådana tekniker som kemisk utfällning och kromatografi
- formulering – det aktuella proteinet modifieras till en stabil, steril form, som kan ges terapeutiskt. Kom ihåg att proteiner inte kan tas som piller därför att de bryts ned i magen.
Överföringen från laboratoriets provrör till industriell fermentering är inte alltid en okomplicerad process. Vart och ett av produktionsstegen kräver allt fler manipulationer för att maximera utbytet av läkemedlet, renhetsgrad, aktivitet och stabilitet.
Detta är enkelt med vissa ämnen, som endast kräver några få processjusteringar. Andra är svårare och kräver mer tid och uppmärksamhet, vilket kan medföra att kostnaden för slutprodukten ökar. Men den blir aldrig högre än kostnaden för att isolera medicinska mängder av ämnen från ursprungskällan, om detta nu ens vore möjligt.
Bakterier eller virus?
Vid framställning av rekombinanta proteiner för terapeutiskt bruk beror renhetsgraden, utbytet, biologiska aktivitet och stabilitet även på typen av cell som används till att framställa proteinet.
Nu för tiden kan många olika slags celler och bakterier användas. Man kan exempelvis använda ett virus till att föra in mänskliga gener i däggdjurs- eller insektscellers DNA, och odla dessa i en kultur.
Vissa av dessa celler växer inte särskilt bra i kultur, och de flesta av dem (bl.a. bakterier) producerar något förändrade proteiner som ofta inte är lika terapeutiskt effektiva som det naturliga humanproteinet.
Ett svårt dilemma
Den uppenbara lösningen på problemet med rekombinanta proteiners minskade aktivitet är att odla proteinerna i människoceller.
Tyvärr går det inte att odla människoceller under de förhållanden som råder vid industriell fermentering, och även om de odlas i liten skala producerar de inte mycket protein. Men tack vare DNA-kodens struktur finns det en väg ur detta dilemma.
Som tidigare sagts utgör en triplett av baser koden för en aminosyra. Om man ändrar ett enda kodon i DNA kan man ändra proteinets aminosyrasekvens.
Precis som i evolutionen är de flesta strukturförändringar av proteiners aminosyrasekvens skadliga. Ibland kan de dock leda till att originalet förbättras. En enda förändrad aminosyra kan förbättra proteinet så mycket att det får samma terapeutiska aktivitet och stabilitet som det naturliga humanproteinet.
(bilden nedan visar molekylär struktur hos interferon beta - 1b)
En blick in i framtiden
När gener modifieras för att framställa ett protein med en något annorlunda aminosyrasekvens förlorar man inget av utbytet eftersom det nya rekombinanta proteinet kan odlas i bakterier, som delar sig snabbare än någon annan typ av celler.
Det finns redan en hel serie av modifierade (andra generationen) rekombinanta proteiner för medicinskt bruk, däribland nya former av insulin, tillväxthormon, vävnadsplasminogen-aktivator, faktor VIII och interferon-beta-1b.
Detta ger nytt hopp för framtiden. Äntligen är det möjligt att påverka förloppet vid sjukdomar som MS. Nu när biotekniken gör det möjligt att framställa stora mängder terapeutiskt protein, kan alla som behöver erbjudas effektiva behandlingar som beta-interferon.
